Как открыли пенициллины

«Серия случайных событий почти невероятной невероятности» – так отзывался об открытии пенициллина британский гематолог Гвин Макфарлейн, автор концепции каскадного свертывания крови [1].

Шотландский бактериолог Александр Флеминг из Медицинской школы Святой Марии Лондонского университета изучал естественное антибактериальное действие крови и антисептиков. В 1921 году он обнаружил в «тканях и секретах» фермент лизоцим, способный, благодаря гидролизу, разрушать клеточные стенки бактерий [2]. В 1928 году Александр вернулся из отпуска в свою лабораторию и обнаружил, что на одной из чашек Петри с культурой золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) бактерия не смогла вырасти на тех участках, на которых выросла зеленая плесень – Penicillium notatum (рис. 1).

Рисунок 1. Penicillium notatum и пенициллин 

В своей статье «Об антибактериальном действии культур пенициллиума с отдельными отсылками к их использованию в изолятах B.influenzae», опубликованной 10 мая 1929 года[3], Флеминг описывает впечатления об увиденном так: «Было замечено, что вокруг большой колонии контаминирующей плесени, колонии стафилококка стали прозрачными и явно подвергались лизису».

Рисунок 2. Изображение из статьи А.Флеминга, 1929 г. – фотография чашки Петри, показывающая растворение колонии стафилококка по соседству с колонией Penicillium.

Зеленую плесень – грибы (представители рода Penicillium) долгое время до этого изучали в различных лабораториях мира. А бельгийский миколог-микробиолог Филибер Бьюрж ( Philibert Biourge) [4] уже написал и в 1923 году издал большую монографию о роде Penicillium «Les moisissures du Penicillium Link» («Плесневые грибы группы Penicillium Link: монографическое исследование») [5]. Он описал 57 видов грибов этого рода, на сегодняшний день их известно больше 300.

Бьюрж создал микотеку – картотеку рисунков, благодаря которым Флеминг так быстро определил героя, победившего золотистый стафилококк на его чашках: «По своей морфологии этот организм является пенициллием и по всем своим признакам он больше всего похож на P. rubrum. Бьюрж (1923) утверждает, что он никогда не находил P. rubrum в природе и назвал его «лабораторным животным». Этот пенициллий не редкость в воздухе лаборатории» [3].

Рисунок 3. Оригинальный рисунок из монографии Ф. Бьюржа, который описал вид P.rubens как Penicillium meleagrinum (для иллюстрации сложности различения разных представителей рода на основе культуральных или микроскопических особенностей).

Вещество, которое не позволяло расти колониям стафилококка, Флеминг назвал «пенициллин»: «... название “пенициллин” было дано фильтратам бульонных культур плесени», которая «по своей морфологии является пенициллием»[3]. Но потенциальные терапевтические преимущества пенициллина Флеминг упомянул вскользь и рассматривал его скорее как эффективный антисептик: «Пенициллин, по-видимому, имеет больше преимуществ по сравнению с известными химическими антисептиками»[3].

В феврале 1928 года Флеминг читает доклад о пенициллине на собрании Медицинского исследовательского общества. Там он впервые говорит о возможном использовании пенициллина для лечения инфекций у людей. Затем Флеминг докладывает о своем открытии на Международном конгрессе микробиологов. Но не встречает никакого интереса со стороны научного сообщества, только скепсис. И это случилось не в первый раз! 

В 1895 году, за 30 лет до открытия Флеминга, итальянский исследователь Винченцо Тиберио опубликовал работу «Об экстрактах некоторых плесеней». В ней очень подробно были описаны его наблюдения, метод выделения антибиотического вещества, демонстрация его действия in vitro, задокументирована эффективность in vivo, оценка эффективных доз и продолжительность антибиотической эффективности полученных экстрактов. Но эта работа не встретила вообще никакого интереса... Возможно, потому, что была опубликована только на итальянском языке [6].

Упорство побеждает скепсис

Флеминг разочаровывается, но попыток выделить чистый пенициллин из бульонной культуры не оставляет [7], хотя возможности его лаборатории не позволяли этого сделать.

Александр обращается за помощью к профессору Гарольду Рейстрику. Этот биохимик и эксперт по грибам из Лондонской школы гигиены и тропической медицины заявил, что «производство пенициллина в терапевтических целях... почти невозможно». Вывод профессора Рейстриха основывался на нескольких аргументах [8]:

• крайняя нестабильность пенициллина в водном растворе при использовании для его выделения кислот, щелочей или бактерий; 
• непригодность в качестве объекта исследования для диссертационных работ; 
• мнение друзей-медиков – пенициллин никогда не сможет быть использован в клинической медицине из-за нестабильности.

Флеминг отправлял образцы Penicillium всем, кто его просит, в надежде, что хоть у кого-нибудь получится выделить пенициллин для клинического использования.

Рисунок 4. Образец плесени пенициллия, подаренный А. Флемингом коллеге из больницы Святой Марии, Лондон, 1935 год. 

Очередной всплеск интереса к выделению пенициллина и его изучению случился только через 10 лет. Эрнст Чейн – сотрудник Школы патологии им. сэра У. Данна Оксфордского университета, нашел почти забытую статью Флеминга 1929 года о пенициллине. Он предложил руководителю школы, профессору Говарду Флори, попытаться изолировать пенициллин из другого штамма Penicillium, который был получен несколькими годами ранее их предшественниками и хранился в лаборатории Оксфорда[1]. 

И в 1939 году начинает работать мультидисциплинарная команда ученых. В ее состав вошли эксперт по выращиванию грибов вида Penicillium Норман Хитли, биохимик Эрнст Чейн, успешно выделивший пенициллин из экстракта плесени, Говард Флори, руководивший экспериментами на животных, и еще несколько ученых: биохимик Эдвард Абрахам, врачи Мэри Этель Флори и Артур Дункан Гарднер, Маргарет Дженнингс, Джин Орр-Юинг и Гордон Сандерс [1] (рис. 5).

Рисунок 5. Флори, Чейн и члены оксфордской группы исследователей пенициллина.

В результате, они разработали и методы выращивания и очистки плесени Penicillium для получения пенициллина, и получили пригодную для исследования на животных серию сырых жидких экстрактов. Для получения достаточного количества пенициллина, необходимо было перерабатывать до 500 литров фильтрата плесени в неделю. Сначала плесень выращивали в ваннах, суднах, маслобойках и консервных банках для еды. Позже разработали специальный резервуар для брожения. Для наблюдения за ферментацией и обновления бульона с культурой была нанята команда из 6 «пенициллиновых девушек» за 2 фунта в неделю. По сути, оксфордская лаборатория превратилась в фабрику по производству пенициллина [9].

Мышиный час и первые пациенты

И вот 25 мая 1939 года 8 мышам вводят вирулентный штамм стрептококка, а затем четырем из них – пенициллин. К утру следующего дня все мыши из группы, которой пенициллин не вводили, погибли, а те, кому пенициллин ввели – были живы! Чейн назвал это чудом. Исследователи опубликовали свои результаты в журнале The Lancet в августе 1940 года. Они полностью описали производство, очистку и экспериментальное использование пенициллина, который обладал достаточной эффективностью для защиты животных, инфицированных Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus и Clostridium septique [10].

После первого успеха, когда было получено достаточно очищенного пенициллина, оксфордская команда смогла оценить его клиническую эффективность и у людей. 

Первым человеком, получившим пенициллин в феврале 1941 года, был 43-летний полицейский Альберт Александр. Он поцарапал уголок рта, обрезая розы, у него развилась опасная для жизни инфекция с огромными абсцессами, поразившими глаза, лицо и легкие. Уже через 24 часа после введения препарата, его состояние поразительно улучшилось. Но запас антибиотика был таким скудным, что закончился до того, как больного удалось полностью вылечить. Он, к сожалению, умер.

Чтобы пополнять запасы и не потерять ни грамма драгоценного препарата, команде пришлось прибегнуть к довольно неприятным мерам. По Оксфорду ездил «П-патруль»[11] – сотрудники команды на велосипедах объезжали дома пациентов и собирали их мочу (около 80% дозы пенициллина выводится из организма с мочой) и экстрагировали из нее пенициллин (рис. 6). 

Рисунок 6. Образец пенициллина, выделенный из мочи. Оксфорд, 1941 г. (инв. № 14439). 

Клинические результаты лечения остальных пациентов были очень хорошими, что задокументировано в публикации в The Lancet [12]. Конечно сразу появились планы сделать пенициллин доступным для британских войск на поле боя, так как шла Вторая мировая война.

К промышленным масштабам

Но крупномасштабное производство пенициллина в Великобритании было невозможно – химическая промышленность работала на военные нужды. А для обширных клинических испытаний и подтверждения полученных обнадеживающих результатов было необходимо достаточное количество препарата. 

Летом 1941 года, при поддержке института Рокфеллера, профессор Флори и его коллега Норман Хитли отправляются в Соединенные Штаты. Они хотят заинтересовать американскую фармацевтическую промышленность производством пенициллина в больших масштабах. С собой они везут бесценный флакон с культурой плесени Penicillium . 

В США супруги встречаются с главным микологом Министерства сельского хозяйства США Чарльзом Томом. Позже, именно он уточнит, что вид, который Флеминг определил как P. rubrum,  – это P. notatum [13]. 

В коллекции Тома было 1000 штаммов Penicillium и только несколько из них продуцировали пенициллин, причем P. notatum был самым малопродуктивным. В итоге, решили использовать другой штамм – P. chrysogenum, найденный в заплесневелой дыне на рынке. Он производил в 6 раз больше пенициллина, чем штамм Флеминга [1]. А в качестве среды для масштабного производства плесени применили кукурузный экстракт. В США он считался отходами производства кукурузного крахмала и был доступен в больших количествах.

Задача промышленного производства была решена. Но необходимые деньги можно было получить, только через государственное финансирование и фармацевтические компании. И это удалось. Правительство США взяло на себя все производство пенициллина, когда Соединенные Штаты вступили во Вторую мировую войну. А исследователи фармацевтических компаний разработали новую технологию (ферментация в глубоком резервуаре), которая позволила производить огромные количества пенициллинпродуцирующих видов Penicillium.

Биг фарма на подхвате

Представители правительства США обратились к четырем фармацевтическим компаниям — Мерк (Merck), Сквиб (Squibb), Лилли ( Lilly ) и Пфайзер (Pfizer)  — с просьбой послужить национальным интересам и начать производство пенициллина при поддержке государства. Руководитель программы по производству пенициллина Альберт Элдер в 1943 году писал: «Вас призывают убедить каждого рабочего на вашем заводе, что пенициллин, производимый сегодня, через несколько дней спасет чью-то жизнь или вылечит болезнь того, кто сейчас нежизнеспособен. Разместите лозунги на вашем заводе! Разместите объявления в конвертах с заработной платой! Вызовите энтузиазм к работе даже у самого простого рабочего на вашем заводе» (рис. 7).

Рисунок 7. Около 20 различных лабораторий в США производили пенициллин для военных нужд. Pfizer сыграла одну из крупнейших ролей в массовом производстве пенициллина.

Сотрудничество США и Великобритании в производстве пенициллина оказалось невероятно успешным. Если в конце 1942 года препарата было достаточно для лечения как минимум 100 пациентов, то к сентябрю 1943 года – для удовлетворения потребности всех вооруженных сил США и их союзников [1]. 

Кстати, активность пенициллина измерялась в оксфордских единицах (оксф. ед.). «Оксфордская единица – это такое количество пенициллина, растворенное в 50 мл мясного экстракта, которое прекращает рост Staphylococcus aureus». Эталонным стандартом была большая партия нечистого пенициллина, хранившаяся в Оксфорде, – препарат активностью 42 единицы пенициллина в 1 мг [14].

Пенициллин и война

Изменения в результатах лечения больных с внедрением пенициллина были РЕВОЛЮЦИОННЫМИ. В связи с этим правительства США и Великобритании пытались сделать максимум, чтобы культура, производящая пенициллин, не оказалась в руках немцев [15]

Американские и британские ученые издавали результаты своей работы с пенициллином практически без ограничений. Однако цензура запрещала публикации, связанные с определением химической структуры препарата и описанием процессов его химического синтеза. Предполагалось, что Германия имеет превосходство в уровне развития органической химии. 

Когда швейцарская компания «CIBA» запросила у профессора Флори образец Penicillium notatum, спецслужбы Британии попытались отследить, где могла оказаться культура Penicillium Флеминга. Сам ученый писал: «За последние 10 лет я разослал очень большое количество культур Penicillium во всевозможные места, но, насколько я помню, НИ ОДНА не отправилась в Германию» [15]. Считалось, что без образца плесени никто в Германии не сможет произвести пенициллин, хотя даже в статье Флори 1940 года уже был описан план его мелкомасштабного производства. 

Однако еще в 30-е годы один из образцов Флеминга всё-таки был отправлен «доктору Джонсу Х. Шмидту» в Германию. А в оккупированной немцами Франции, в институте Пастера, после публикаций в прессе, нашли образец, который Флеминг отправил Андре Львоффу десятью годами ранее. Из него Фредерик Нитти получил очень небольшое количество пенициллина. Немецкие власти потребовали образец культуры и Нитти отдал им образец с аморфным штаммом пенициллина, из которого невозможно выделить пенициллин. Нитти был одним из участников движения Сопротивления во Франции и создателем тайной сети, поставляющей лекарства, вакцины и медицинское оборудование Внутренним силам Франции (FFI)[16].

Другой образец Penicillium notatum Флеминга нашелся в Нидерландах, которые также находились под немецкой оккупацией. Туда, тоже еще в 30-х, он был отправлен Йоханне Вестердейк, директору самой большой в мире коллекции грибов и плесени (Центрального бюро культуры плесени), расположенной в Утрехте. В феврале 1942 года нацисты обратились с просьбой прислать им образец. Голландцы ответили, что у них нет штамма Флеминга и, так же как и во Франции, немцам отправили штамм пенициллина, не способный продуцировать активный пенициллин. 

Но сами голландцы решили начать тайное производство пенициллина. В 1943 году образец Флеминга и еще 18 штаммов были переданы на фабрику NG&SF по производству дрожжей и спиртных напитков, так как хранить их в бюро стало опасно. Из них выбрали тот, который продуцировал больше всего пенициллина. Это был штамм P. baculatum. Как производить пенициллин было не очень понятно, в тот момент в руках была лишь статья Флеминга 1929 года. И только в июне 1944 года им передали «Швейцарский медицинский журнал» со статьей, подробно описывающей производство пенициллина и положившей конец многим секретам: результатам, полученным союзниками, способам производства, выявлению чувствительных к антибиотикам бактерий. И в NG&SF приступили к производству. Дело осложнялось тем, что за деятельностью фабрики следил немецкий охранник, к счастью, ничего не понимающий в микробиологии. Из воспоминаний сотрудников: «У нас был немецкий охранник, чья работа заключалась в том, чтобы держать нас под наблюдением, но он любил джин, поэтому мы позаботились, чтобы у него его было много. Большую часть дня он дремлет». Уже с января 1946 года NG&SF с большим успехом продавала свой пенициллин. 

Что касается немцев, то им удалось произвести свой пенициллин в октябре 1944 года. Но было уже слишком поздно [1]. 

История патента 

Вопрос о патенте на пенициллин с самого начала был спорной проблемой. Часть оксфордской команды считала патенты неэтичными для такого жизненно важного препарата. Кроме того, пенициллин — натуральный продукт, произведенный другим живым микроорганизмом, как его патентовать? И ни один британский ученый не оформил патент. В результате, патент на процесс производства был оформлен фармацевтической компанией Merck, а британская команда за открытие получила гонорар. Патент также был оформлен голландской фабрикой NG&SF, так как они разработали свой собственный пенициллин, из собственной культуры плесени P. baculatum, и использовали свои собственные методы производства[1].

Пенициллин и СССР

В Советском Союзе активно интересовались открытиями Флеминга и группы Флери, а позже, и результатами использования пенициллина в США. Архивные дела фондов Народного комиссариата здравоохранения СССР, Совета министров СССР в архиве РФ (ГАРФ) содержат «справки по пенициллину» с грифом «Секретно» или «Совершенно секретно». Это говорит о прекрасной осведомленности руководства страны о результатах исследований и производстве пенициллина за рубежом [17]. Эти справки очень подробны, особенно, если учесть, что информация о пенициллине была в США государственной тайной. В них описаны:

• объемы производства: в 1943 г. – 21 192 млн оксф. ед., соответствующих 12 873 граммам пенициллина, а с января по март 1944 г. – 40 000 млн оксф. ед.,
• количество заводов по производству – 21,  
• стоимость, которая в первый период производства препарата составляла около 20 долларов за 100 000 оксф. ед., в 1944 г. снизилась до 3,5 доллара (на 84%) и имела тенденцию к дальнейшему снижению [17]. 

По всей видимости, эта информация была доступна и нашим ученым, которые работали над проблемой создания советского пенициллина. 

5 февраля 1944 г. в Москве на заседании Президиума Ученого медицинского совета Наркомздрава СССР присутствует иностранная делегация. В ее состав входит и профессор Флори, руководитель оксфордской команды. В стенограмме этого заседания зафиксированы его слова: «На меня особенно большое впечатление произвела та энергия и то искусство, с которым вы получили результаты с пенициллином в Москве за короткий срок».

Его удивление было вполне оправдано – мы помним, какие усилия предприняла его команда для начала производства пенициллина, сначала в Оксфорде, а затем и в США. Над созданием препарата работала очень большая высокопрофессиональная междисциплинарная и международная команда ученых (порядка 400-500 человек). В ее распоряжении было первоклассное лабораторное оборудование. И тем не менее путь от публикации Флеминга 1929 года до запуска препарата в производство в 1942 году занял почти 13 лет. Отдел же биохимии микробов Всесоюзного института экспериментальной медицины состоял из 9 сотрудников, во главе с хорошо известной нашим читателям Зинаидой Ермольевой. Они начали исследования в этом направлении лишь в октябре 1942 г. [18], в тяжелейших условиях войны, испытывая постоянные трудности с электроснабжением, химическими реактивами, аппаратурой. Но в начале 1944 г. представили зарубежным гостям не только «советский пенициллин», но и линию его производства. 

Зинаида Виссарионовна Ермольева на том же заседании с иностранными коллегами сказала: «Работа по пенициллину привлекла наше внимание потому, что автором этого препарата является Флеминг, являющийся также автором лизоцима, с которым наша лаборатория работала много лет. <…> На препарат пенициллина мы обратили особое внимание с начала войны, когда появились работы Флори и Абрагама, когда мы получили сведения о методе очистки этого препарата и его клиническом применении». Она считала главным своим достижением выделение отличного от штамма Флеминга (Penicillium notatum) штамма для получения пенициллина – Penicillium crustosum [18]. 

Рисунок 8. Книга З.В. Ермольевой «Пенициллин» 

Почитать книгу З.В. Ермольевой «Пенициллин» можно по ссылке: http://exibitions.jscc.ru/ermoleva/book/10097426/ 

Впервые советский пенициллин был применен 20 июля 1943 г. в клинике проф. Руфанова [19], но о промышленном производстве этого препарата можно было только мечтать. Опытное производство пенициллина позволяло к весне 1945 года получить 500 млн оксф. ед. в год. Это было «каплей в море», так как «расход на курс лечения составляет от 50 тыс. до 1,5 млн оксф. ед. в зависимости от заболевания».

Уже в конце войны начались поставки пенициллина от союзников Советского Союза на пароходах из США вместе с другими медицинскими грузами [17]

Нобелевская премия

Гигантский шаг вперед в лечении инфекций был очень высоко оценен мировым научным сообществом. В 1945 году сэру А. Флемингу, Э. Борису Чейну и сэру Г. Уолтеру Флори была присуждена Нобелевская премия по медицине и физиологии «За открытие пенициллина и его лечебное действие при различных инфекционных заболеваниях» [20]. 

В своей Нобелевской речи, Флеминг сказал: «Много лет я читал о людях, получивших Нобелевскую премию. Тогда я всегда считал их высшим классом, которого почти невозможно было достичь. И вдруг я оказываюсь в этом классе и задаюсь вопросом, такие ли они разные. Добились ли они этой великой награды (а ведь это действительно величайшая награда, которую может получить ученый) глубоким размышлением или в этом сыграла роль госпожа Фортуна? Мы все знаем этот шанс, удачу или судьбу – назовите это как угодно – которые сыграли значительную роль во многих великих открытиях в науке. Мы не знаем, сколько именно, поскольку все ученые, открывшие что-то новое, не раскрыли точно, как это произошло. Однако мы знаем, что во многом именно случайное наблюдение вывело их на путь, который в конечном итоге привел к реальному прогрессу в знаниях и практике. Особенно это касается биологических наук, т.к. там мы имеем дело с живыми механизмами, о которых у нас огромные пробелы в знаниях» [21]. 

Так, «серия случайных событий почти невероятной невероятности» или «Фортуна» привели к тому, что в руки врачей попал инструмент, спасающий жизни. 

Литература

1. ^{Gaynes R. The Discovery of Penicillin–New Insights After More Than 75 Years of Clinical Use. Emerg Infect Dis. 2017; 23(5): 849-853}
2. ^{https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1945/fleming/biographical/}
3. ^{Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a Penicillium with special reference to their use in the isolation of B. influenza. Br J Exp Pathol. 1929;10:226–3}
4. ^{https://fr.wikipedia.org/wiki/Philibert_Biourge}
5. ^{Biourge Philibert. Les Moisissures Du Groupe Penicillium Link (Etude Monographique); January 1, 1923}
6. ^{В TIBERIO V., Sugli estratti di alcune muffe. Annali d’igiene sperimentale 1895; V: 91-103.}
7. ^{Allison VD. Personal recollections of Sir Almroth Wright and Sir Alexander Fleming. Ulster Med J. 1974;43(2):89-98}
8. ^{https://royalsocietypublishing.org/doi/pdf/10.1098/rsbm.1972.0017}
9. ^{E. Chain, H.W. Florey, A.D. Gardner, N.G. Heatley, M.A. Jennings, J. Orr-Ewing, A.G. Sanders, PENICILLIN AS A HEMOTHERAPEUTIC AGENT, The Lancet, Volume 236, Issue 6104, 1940, Pages 226-228 https://www.sciencedirect.com/sdfe/pdf/download/eid/1-s2.0-S0140673601087281/first-page-pdf}
10. ^{«Открытие и разработка пенициллина в 1928–1945 годах», Американское химическое общество и Королевское химическое общество, 1999 г. https://www.acs.org/education/whatischemistry/landmarks/flemingpenicillin.html}
11. ^{https://www.mhs.ox.ac.uk/backfromthedead/exhibition/consumption/}
12. ^{Abraham EP, Gardner AD, Chain E, Fletcher CM, Gardner AD, Heatley NG, et al. Further observations on penicillin. Lancet. 1941; 238:177–88}
13. ^{Macfarlane G. Alexander Fleming: the man and the myth. Cambridge (MA): Harvard University Press; 1984.}
14. ^{Данилова Е. А. История развития химико-фармацевтической промышленности. Иваново: Ивановский государственный химико-технологический университет; 2013}
15. ^{Shama G. Zones of inhibition? The transfer of information relating to penicillin in Europe during World War II. In: Laskin, AI., editor. Advances in applied microbiology. New York: Academic Press, Inc.; 2009. Vol 69, Chap. 5, pp. 133–58.}
16. ^{Gaudillière, Jean-Paul, and Bernd Gausemeier. «Molding National Research Systems: The Introduction of Penicillin to Germany and France». Osiris, vol. 20, 2005, pp. 180–202. JSTOR}
17. ^{Шерстнева Е.В. История создания советского пенициллина: вымысел и факты.Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. Июль 2019; 27(4):507-512}
18. ^{Ермольева З.В. Холера. М., Медгиз, 1942.}
19. ^{Бурденко Н. Н. Письма хирургам фронтов о пенициллине. М.; 1945. с. 24}
20. ^{https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1945/summary/}
21. ^{Флеминг А. Нобелевская речь. 1945 https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1945/fleming/speech/}
22. ^{https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/23/5/16-1556_article}